Was liegt der DNA-Hybridisierung zugrunde? Obwohl die doppelsträngige DNA-Sequenz unter physiologischen Bedingungen im Allgemeinen stabil ist, führt eine Änderung dieser Bedingungen im Labor (typischerweise durch Erhöhen der Umgebungstemperatur) dazu, dass sich die Moleküle in einzelne Stränge trennen. Letztere sind komplementär zueinander, können aber auch andere in ihrer Umgebung vorhandene Sequenzen ergänzen. Das Absenken der Umgebungstemperatur ermöglicht es den einzelsträngigen Molekülen, miteinander zu hybridisieren oder zu "hybridisieren". Dies ist die DNA-Hybridisierungsmethode.
Das Konzept aus molekularbiologischer Sicht
Wissenschaftler, die sowohl an der DNA-Replikation als auch an der Transkription von DNA in RNA beteiligt sind, verlassen sich auf Nukleotid-Crossovers und molekularbiologische Techniken. Dazu gehören Southern- und Northern-Blots, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die meisten DNA-RNA-Hybridisierungs- und Sequenzierungsansätze.
Bewerbung
Hybridisierung ist die Haupteigenschaft von NukleotidenSequenzen und wird in zahlreichen Methoden der Molekularbiologie verwendet. Die gesamte genetische Verwandtschaft zweier Arten kann durch Hybridisierung von Abschnitten ihrer DNA (DNA-DNA-Hybridisierung) bestimmt werden. Aufgrund von Sequenzähnlichkeiten zwischen eng verwandten Organismen ist eine höhere Temperatur erforderlich, um solche DNA-Hybride im Vergleich zu weiter entfernten Organismen zu schmelzen. Verschiedene Methoden verwenden die Hybridisierung, um den Ursprung einer DNA-Probe zu bestimmen, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Bei einem anderen Verfahren werden kurze DNA-Sequenzen mit zellulärer mRNA hybridisiert, um exprimierte Gene zu identifizieren. Pharmaunternehmen untersuchen die Verwendung von Antisense-RNA, um an unerwünschte mRNA zu binden und das Ribosom daran zu hindern, mRNA in Protein zu übersetzen.
DNA-DNA-Hybridisierung bezieht sich im Allgemeinen auf eine molekularbiologische Technik, die den Grad der genetischen Ähnlichkeit zwischen Pools von DNA-Sequenzen misst. Es wird häufig verwendet, um die genetische Distanz zwischen zwei Organismen zu bestimmen. Es ist in der Phylogenie und Taxonomie weit verbreitet.
Methodik
DNA von einem Organismus wurde markiert und dann mit unmarkierter DNA gemischt, die damit verglichen werden konnte. Das Gemisch wird inkubiert, damit die DNA-Stränge dissoziieren können, und dann abgekühlt, um eine regenerierte hybride doppelsträngige DNA zu bilden. Hybridisierte Sequenzen mit einem hohen Ähnlichkeitsgrad binden fester und erfordern mehr Energie, um sie zu trennen: d. h. sie trennen sich, wenn sie auf eine höhere Temperatur erhitzt werdenTemperatur als unterschiedliche Sequenzen, ein Prozess, der als "DNA-Schmelzen" bekannt ist.
DNA-Schmelzen
Auswertung des Schmelzprofils der hybridisierten DNA, die doppelsträngige DNA wird an eine sogenannte "Säule" gebunden und die resultierende Mischung erhitzt. Bei jedem Schritt wird die Säule gewaschen und die schmelzenden DNA-Sequenzen werden einzelsträngig und werden von der Säule abgewaschen. Die Temperaturen, bei denen markierte DNA die Säule verlässt, spiegeln das Ausmaß der Ähnlichkeit zwischen Sequenzen wider (und das Selbstf altungsmuster dient als Kontrolle). Diese Ergebnisse werden kombiniert, um den Grad der genetischen Ähnlichkeit zwischen Organismen zu bestimmen. Gemäß der modernen Mikrobiologie ist eine DNA-Hybridisierung unmöglich, ohne diese Dinge zu verstehen.
Wenn mehrere Ribonukleinsäure- (oder Desoxyribonukleinsäure-) Säurearten auf diese Weise verglichen werden, ermöglichen die Ähnlichkeitswerte die Einordnung der Arten in den Stammbaum. Daher ist dies einer der möglichen Ansätze zur Durchführung molekularer Systematik. Charles Sibley und John Ahlquist, die Pioniere dieser Technik, verwendeten die DNA-DNA-Hybridisierung, um die phylogenetischen Beziehungen zwischen Vögeln (Sibley-Ahlquist-Taxonomie) und Primaten zu untersuchen.
Bedeutung für die Biologie
DNA-DNA-Hybridisierung ist der Goldstandard zur Unterscheidung von Bakterienarten, mit einem Ähnlichkeitswert von mehr als 70 %, der darauf hinweist, dass die verglichenen Stämme zu verschiedenen Arten gehören. Im Jahr 2014 wurde ein Schwellenwert von 79 % Ähnlichkeit für die Trennung einer bakteriellen Unterart vorgeschlagen.
Kritiker behaupten, dass die Technik für den Vergleich eng verwandter Arten ungenau ist, da jeder Versuch, Unterschiede zwischen orthologen Sequenzen zwischen Organismen zu messen, durch die Hybridisierung paraloger Gegenstücke im Genom eines Organismus überwältigt wird. DNA-Sequenzierung und Computersequenzvergleiche sind derzeit die am häufigsten verwendete Methode zur Bestimmung der genetischen Distanz, obwohl dieser Ansatz in der Mikrobiologie immer noch verwendet wird, um Bakterien zu identifizieren.
Der aktuelle Weg ist die DNA-DNA-Hybridisierung in Silikon unter Verwendung vollständig oder teilweise sequenzierter Genome. Das von der DSMZ entwickelte GGDC ist das genaueste bekannte Werkzeug zur Berechnung von DDH-ähnlichen Werten. Neben anderen algorithmischen Verbesserungen löst es das Problem mit paralogen Sequenzen, indem es sie sorgfältig aus Übereinstimmungen zwischen zwei Genomsequenzen herausfiltert.
FISH-Methode
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Labortechnik zum Nachweis und zur Sequenzierung von DNA, oft auf einem bestimmten Chromosom.
Im Jahr 1969 veröffentlichten Joseph Gall und Mary Lou Pardu eine Arbeit, die zeigte, dass radioaktive Kopien einer ribosomalen DNA-Sequenz verwendet werden könnten, um komplementäre DNA-Sequenzen im Zellkern eines Froscheis nachzuweisen. Seit diesen ursprünglichen Beobachtungen haben viele Verfeinerungen die Vielseitigkeit erhöht unddie Sensitivität des Verfahrens so hoch, dass die In-situ-Hybridisierung („in place“, lat.) heute als wichtiges Werkzeug in der Zytogenetik gilt. (Der Begriff in situ wird jetzt auch verwendet, um sich auf das Anfangsstadium des Karzinomwachstums zu beziehen, wenn nur Epithelgewebe am pathologischen Prozess beteiligt ist.)
Fluoreszenz-Hybridisierungssequenz
RNA-Sonden können für jedes Gen oder jede Sequenz innerhalb eines Gens entwickelt werden, um lncRNA und miRNA mRNA in Geweben und Zellen sichtbar zu machen. FISH wird verwendet, um den Zyklus der Zellreproduktion zu untersuchen, insbesondere die nukleare Interphase auf Chromosomenanomalien. Mit FISH können Sie eine große Reihe von Archivfällen analysieren. Es ist viel einfacher, das identifizierte Chromosom zu identifizieren, indem Sie eine Sonde mit einer künstlichen Chromosomenbasis erstellen, die ähnliche Chromosomen anzieht.
Hybridisierungssignale für jede Sonde, wenn eine Kernanomalie festgestellt wird: Jede mRNA- und lncRNA-Nachweissonde besteht aus 20 Oligonukleotidpaaren, wobei jedes Paar einen Bereich von 40-50 bp abdeckt. S. Sonden verwenden proprietäre Chemie zum Nachweis von mRNA.
Hybridisierung mit DNA-Sonden
Sonden werden oft aus DNA-Fragmenten hergestellt, die isoliert, gereinigt und amplifiziert wurden, um sie beim Design des menschlichen Genoms zu verwenden. Die Größe des menschlichen Genoms ist so groß im Vergleich zu der Länge, die direkt sequenziert werden kann, dass es notwendig ist, es zu unterteilenFragmente. Letztendlich wurden diese Fragmente geordnet, indem eine Kopie jedes Fragments unter Verwendung sequenzspezifischer Endonukleasen in noch kleinere Einheiten verdaut wurde, um die Größe jedes kleinen Fragments unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie zu messen, wobei diese Informationen verwendet wurden, um zu bestimmen, wo sich große Fragmente überlappten
Um die Elemente mit ihren individuellen DNA-Sequenzen zu erh alten, wurden die Fragmente einem System sich ständig wiederholender Bakterienpopulationen hinzugefügt. Klonale Bakterienpopulationen, bei denen jede Population ein einzelnes künstliches Chromosom enthält, werden in verschiedenen Labors auf der ganzen Welt gelagert. Künstliche Chromosomen (BACs) können in jedem Labor, das über eine Bibliothek verfügt, gezüchtet, extrahiert und markiert werden. Genombibliotheken werden oft nach den Institutionen benannt, in denen sie entwickelt wurden. Ein Beispiel ist die RPCI-11-Bibliothek, benannt nach dem Roswell Cancer Institute in Buffalo (New York, USA). Diese Fragmente bestehen aus etwa 100.000 Basenpaaren und sind die Basis der meisten FISH-Sonden.
