Kultivierung von Bakterien: Methoden, Prinzipien, Schritte und Bedingungen

2024 Autor: Angel Austin | [email protected]. Zuletzt bearbeitet: 2023-12-17 05:21

Mikroorganismen in der uns umgebenden Natur sind allgegenwärtig: in Böden, Gewässern, auf Oberflächen verschiedenster Gegenstände, Menschen und Tiere werden von ihnen bewohnt. All dies kann als Quelle für eine mikrobielle Kontamination von Lebensmitteln, Arzneimitteln und Produktionslinien dienen. Die Kultivierung von Bakterien ist notwendig, um ihre Eigenschaften, Bedürfnisse und Eigenschaften zu untersuchen. Dies wiederum ist ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung verschiedener Medikamente, der Labordiagnostik von Krankheiten, der Berechnung von Produktionsreaktoren und vielem mehr.

Allgemeine Konzepte

Bakterienkultivierung in der Mikrobiologie bezeichnet die im Labor durchgeführte Kultivierung von Mikroorganismen. Als Kultur bezeichnet man wiederum Mikroben, die auf einem ausgewählten Nährmedium gewachsen sind. Kulturen können gemischt werden, wenn sie von verschiedenen Arten von Mikroorganismen gebildet werden, und rein, wenn sie nur von einer Bakterienart repräsentiert werden.

Wenn nahrhaftEs wird nur eine Zelle in das Medium gegeben und durch ihre Reproduktion eine Gruppe von Individuen erh alten, dann wird diese Gruppe von Mikroorganismen als Klon bezeichnet. Wenn sich ein Klon bis zu dem Punkt entwickelt, an dem er mit bloßem Auge sichtbar wird, wird diese Ansammlung von Bakterien Kolonie genannt.

Normalerweise erfolgt die Kultivierung von Bakterien, die aus unterschiedlichen Quellen isoliert wurden, getrennt voneinander. Jede solche separat gezüchtete Gruppe von Mikroben wird als Stamm bezeichnet. Wenn also eine Art von Staphylokokken aus drei Quellen (oder verschiedenen Portionen desselben Produkts, verschiedenen Personen) isoliert wird, spricht man von drei Stämmen dieser Art von Staphylokokken.

Bakterienwachstumsfaktoren

Dazu gehören verschiedene Aminosäuren, Lipide, Purinbasen und andere Verbindungen, die für die Entwicklung von Mikroorganismen notwendig sind. Manche Mikroben können die benötigten Substanzen selbstständig herstellen, andere müssen sie in fertiger Form erh alten. Entsprechend den Bedürfnissen von Mikroorganismen in bestimmten Wachstumsfaktoren werden Identifizierung und Differenzierung von Bakterien durchgeführt. Auch dieser Parameter ist wichtig für die richtige Herstellung eines Nährmediums für Labor- und biotechnologische Arbeiten:

• Aminosäuren. Bakterien können eine bestimmte Aminosäure oder Gruppe von Säuren benötigen. Clostridien brauchen also Leucin und Tyrosin, Streptokokken brauchen Leucin und Arginin. Mikroorganismen, die zum Wachstum Aminosäuren von außen benötigen, werden Auxotrophe genannt.
• Purin- und Pyrimidinbasen sowie deren Derivate (Adenin, Guanin und andere). Sie sind ein wichtiger Faktor für das Wachstum vielerStreptococcus-Spezies.
• Vitamine. Sie sind Teil der von Bakterien benötigten Coenzyme. Nikotinsäure sowie ihr Amid, die Teil von NAD und NADP sind, werden also von Diphtherie- und Shigella-Corynebakterien benötigt. Thiamin wird als integraler Bestandteil von Pyrophosphat von Staphylococcus aureus, Pneumococcus, Brucella benötigt. Pantothensäure, die Teil des Coenzyms CoA ist, wird von Tetanusbakterien und bestimmten Arten von Streptokokken benötigt. Cytochrome und damit die sie bildenden Folsäuren, Häme und Biotin sind für Mycobacterium tuberculosis und Haemophilus influenzae notwendig.

Umgebungsanforderungen

Bedingungen für Nährmedien zur Anzucht von Bakterien:

1. Ernährung. Sie müssen außerdem Substanzen in einer leicht verdaulichen Form enth alten, die für Mikroorganismen notwendig sind, um sich zu ernähren und Energie zu tanken. Dazu gehören Organogene und Mineralien. Einige Mikroorganismen benötigen zusätzlich Vitamine und Aminosäuren, die sie nicht selbst synthetisieren können.
2. Optimaler pH-Wert. Es beeinflusst die Durchlässigkeit der Zellmembran und dementsprechend die Fähigkeit, Nährstoffe durch das Bakterium aufzunehmen. Meistens sollte der pH-Wert bei 7, 2–7, 4 liegen. Viele Mikroorganismen produzieren im Laufe ihres Lebens Produkte mit sauren oder alkalischen Reaktionen, und damit sich der pH-Wert des Nährmediums nicht ändert, es muss gepuffert werden.
3. Isotonisch. Der osmotische Druck im Nährmedium für die Kultivierung von Bakterien sollte die gleichen Werte haben wieinnerhalb mikrobieller Zellen. Sie entspricht in der Regel einer 0,5 %igen NaCl-Lösung.
4. Sterilität. Dies liegt daran, dass das Auftreten fremder Bakterien die Ergebnisse der Untersuchung des analysierten Stamms verfälscht.
5. Feuchtigkeitsstufe. Dieser Indikator sollte zusammen mit der Konsistenz des Mediums optimale Eigenschaften für eine bestimmte Bakterienart aufweisen.
6. Redoxpotential (RH2). Sie zeigt das Verhältnis von Elektronen abgebenden und aufnehmenden Stoffen sowie den Grad der Sauerstoffsättigung des Nährmediums. Für Aerobier und Anaerobier unterscheiden sich die Bedingungen für die Kultivierung von Bakterien in diesem Indikator etwas. Anaerobe Mikroorganismen vermehren sich am besten bei RH2-Werten unter 5 und aerobe Mikroorganismen bei mindestens 10.
7. Einheitlichkeit. Wichtig ist, dass das Kulturmedium konstante Mengen seiner einzelnen Inh altsstoffe enthält. Außerdem werden klare Lösungen bevorzugt, die es einfacher machen, das Pflanzenwachstum zu überwachen oder Kontaminationen festzustellen.

Arten von Nährmedien

Die Wahl eines bestimmten Mediums für das Wachstum von Mikroorganismen wird von vielen Faktoren beeinflusst, darunter die Merkmale ihrer Ernährung und der Zweck der Studie. Die Hauptmerkmale, die der Klassifizierung von Nährmedien zugrunde liegen, sind:

1. Komponenten. Je nach Ausgangssubstanz zur Herstellung des Substrats unterscheidet man:

• naturbelassen, die aus Produkten tierischen oder pflanzlichen Ursprungs (z. B. Fleisch, Milch, Obst) hergestellt werden und für den Mischanbau geeignet sindGetreide;
• halbsynthetisch, bei denen teure natürliche Lebensmittelprodukte durch Non-Food-Produkte (z. B. Knochenmehl, Blutgerinnsel) ersetzt werden und die sich optimal eignen, um bestimmte Bakterienarten zu kultivieren oder deren Stoffwechselprodukte aus ihnen zu isolieren Umgebung;
• synthetisch, die aus genauen Mengen chemischer Verbindungen hergestellt werden, eine bekannte konstante Zusammensetzung haben und leicht reproduzierbar sind.

2. Konsistenz (Dichte). Umgebungen unterscheiden:

• flüssig;
• dicht;
• halbflüssig.

Die letzten beiden werden aus speziellen Lösungen oder flüssigen Substanzen unter Zugabe von Agar-Agar oder Gelatine hergestellt, um die erforderliche Dichte zu erreichen. Darüber hinaus ist eine dichte Umgebung für das Wachstum von Bakterien geronnenes Blutserum, Kartoffeln, Kieselgelmedien, Carrageenan.

3. Verbindung. Auf dieser Grundlage sind die Umgebungen:

• einfach, die Liste ist kurz: Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), Nährgelatine und Peptonwasser.
• komplex, hergestellt aus einfachen unter Zugabe von Blut, Molke, Kohlenhydraten und anderen Stoffen.

4. Termin. Folgende Nährmedien werden unterschieden:

• main werden verwendet, um viele pathogene Mikroben zu züchten (normalerweise einfache Zusammensetzung);
• spezielle werden verwendet, um Bakterien zu isolieren und zu kultivieren, die auf einfachen Substraten nicht wachsen;
• selektiv (sie sind auch selektiv) eignen sich zur Isolierung einer bestimmten Bakterienart und hemmen das Wachstum assoziierter Mikroben (Selektivitätdurch Zugabe bestimmter Substanzen zu den Medien, wie Antibiotika oder Salze, oder durch Einstellen des pH-Werts);
• Differentialdiagnostik ermöglicht es, eine Bakterienart von einer anderen zu unterscheiden, indem beispielsweise die enzymatische Aktivität des Mediums beurteilt wird;
• Konservierungsmittel werden für die anfängliche Inokulation mit anschließendem Probentransport benötigt, da sie das Absterben von Mikroorganismen verhindern und das Wachstum anderer Bakterien hemmen.

Medienvorbereitung

Der wichtigste Schritt bei der Kultivierung anaerober Bakterien ist die Herstellung eines geeigneten Nährmediums. Nachdem die optimalen Parameter ausgewählt wurden, fahren Sie mit den folgenden Schritten fort:

• Wiegen, indem eine Probe von Komponenten auf einer Analysenwaage ausgewählt wird;
• Auflösung in auf 70 °C erhitztem destilliertem Wasser durchgeführt und Phosphate, Mikro- und Makrosalze getrennt gelöst;
• 2 Minuten im Wasserbad kochen;
• pH-Bestimmung mit Indikatorpapier oder Potentiometer;
• Filtration durch nasse Stoff- oder Papierfilter für flüssige sowie geschmolzene dichte Medien und durch einen Baumwollgazefilter für Agarmedien;
• Abfüllung auf 3/4 Kapazität durchgeführt;
• mittelabhängige Sterilisation;
• Kontrolle auf Sterilität erfolgt durch zweitägiges Absetzen in einem Thermostaten, gefolgt von Sichtung;
• chemische Kontrolle, um den pH-Wert und den Inh alt des Notwendigen herzustellenArtikel;
• biologische Bekämpfung durch Probeimpfung.

Sterilisation von Glaswaren und Medien

Eines der Grundprinzipien der Bakterienkultivierung ist die Sterilität. Das Wachstum und die Entwicklung fremder Mikroorganismen kann die Eigenschaften des Nährmediums beeinflussen, indem es seine chemische Zusammensetzung und seinen pH-Wert verändert. Die Sterilisation ist die Hauptbedingung für die Züchtung von Reinkulturen. In der Praxis bedeutet dieser Begriff die Methoden der Zerstörung absolut aller Lebensformen auf der Oberfläche und im Volumen von sterilisierten Objekten. Gefäße, verwendete Instrumente, Medien und andere Gegenstände, die während der Studie verwendet werden, werden sterilisiert.

Einige Arten der Sterilisation:

• Zündung. Die Sterilisation von Ösen und Nadeln zum Impfen, Glasobjektträgern und einigen Instrumenten kann mit einem Brenner oder einer Spirituslampe durchgeführt werden.
• Kochen. Geeignet für den Umgang mit Spritzen, Nadeln und Lebensmitteln, tötet jedoch keine Bakteriensporen ab.
• Trockenhitzesterilisation. Sie wird in einem speziellen Trockenschrank durchgeführt und eignet sich zur Aufbereitung von Flaschen, Reagenzgläsern und anderen Laborglaswaren.
• Dampfsterilisation. Diese Methode wird im Autoklaven durchgeführt und ist sehr effektiv. Es ist jedoch nicht für Nährmedien geeignet, die Proteine oder andere Verbindungen enth alten, die sich bei hohen Temperaturen zersetzen. Mehr Schonung kann als Tyndalisierung bezeichnet werden. Sie wird im Kochkessel durchgeführt und kombiniert die Keimung der Sporen mit ihrer Vernichtung.
• Pasteurisierung. Es ist für Medien, die beim Kochen ihre Eigenschaften verändern (z. B. Milch, Wein, Bier), in der Lagesie von nicht sporentragenden Mikroorganismen befreien. Die Verarbeitungstemperatur beträgt nur 50-60 ° C für fünfzehn bis dreißig Minuten. In einigen Fällen wird eine K altsterilisation verwendet, die mit Filtern oder UV-Strahlen durchgeführt wird.

Bakterienkultivierungsbedingungen

Das Wachstum und die Entwicklung von Bakterien ist nur unter bestimmten Faktoren und den jeweiligen Werten möglich:

1. Temperatur. Es gibt drei Gruppen von Bakterien, die sich in ihren Temperaturpräferenzen unterscheiden:

• thermophile oder wärmeliebende Mikroben wachsen bei 45-90°C, was bedeutet, dass sie sich in menschlichen und tierischen Organismen nicht vermehren;
• Psychrophile oder kälteliebende Mikroorganismen bevorzugen Temperaturen im Bereich von 5-15 °C und werden in Kühlhäusern gezüchtet;
• Mesophile, entwickeln sich bei einer Temperatur von 25-37 °C, sie umfassen den Großteil der Bakterien.

2. Hell. Es ist ein Merkmal der Kultivierung von phototrophen Bakterien, da sie den photosynthetischen Prozess durchführen. Aber für die meisten Mikroben ist Beleuchtung keine Voraussetzung. Und sogar umgekehrt kann das ultraviolette Sonnenlicht ihre Entwicklung unterdrücken.

3. Wasser. Alle Mikroorganismen benötigen Wasser in zugänglicher (flüssiger) Form. Deshalb hat Tiefkühlkost wenig bis gar kein Bakterienwachstum.

4. Säure der Umgebung. Auf dieses Prinzip der Bakterienkultivierung wurde oben bereits ausführlich eingegangen.

5. Belüftung. Sauerstoff ist als chemisches Element ein wesentlicher Bestandteil des Wassers und wird für eine beträchtliche Anzahl von Verbindungen verwendetKultivierung von Mikroorganismen. Gasförmiger Sauerstoff kann auch in Wasser und anderen Flüssigkeiten in gelöster Form enth alten sein. Ein erheblicher Teil der Bakterien benötigt eine ständige Versorgung mit Sauerstoffmolekülen. Aber für eine Reihe von Mikroorganismen ist es unnötig, oder schlimmer noch, gasförmiger Sauerstoff ist für sie giftig, da sie keine Katalase und Peroxidase haben, die toxische Atemwegsprodukte zerstören. Daher ist der wichtigste Schritt bei der Kultivierung anaerober Bakterien die Entfernung von O2 _{Molekülen aus dem Nährmedium.}

6. Kultivierung von Mikroorganismen. Die Kultivierung von aeroben und anaeroben Bakterien erfolgt in verschiedenen Schichten der Umgebung und auf unterschiedliche Weise.

Kultivierung aerober Mikroorganismen

Die Kultivierung aerober Bakterien erfordert molekularen Sauerstoff. Um Reinkulturen von Aerobiern zu erh alten, die in Medizin und Lebensmittelindustrie erfolgreich eingesetzt werden können, werden folgende Methoden angewendet:

• Oberflächenwachstum auf dichten Medien oder in flüssigen Medien (ihre dünne Schicht), wenn Sauerstoff direkt aus der Luft kommt;
• Tiefenkultivierung in flüssigen Medien, wenn durch ständige Belüftung eine Erhöhung der darin gelösten Sauerstoffmenge erreicht wird.

Kultivierung anaerober Mikroorganismen

Das Grundprinzip der Kultivierung solcher Bakterien ist ihr minimaler Kontakt mit Luftsauerstoff. Die Bedingungen für ihr Wachstum zu schaffen, ist viel schwieriger als für Aerobier. Die folgenden Methoden werden verwendet, um Anaerobier aus molekularem O zu isolieren₂:

1. Physisch. Diese Methode der Kultivierung anaerober Bakterien reduziert sich auf ihre Kultivierung in einem speziellen Vakuumapparat - einem Mikroanaerostaten. Die darin enth altene Luft wird durch ein spezielles Gasgemisch aus Stickstoff unter Zugabe von 10 % Wasserstoff und 5 % Kohlendioxid ersetzt.
2. Chemikalie. Dazu gehören: Verwendung von Absorptionsmitteln (z. B. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) oder Reduktionsmittel (z. B. Ascorbinsäure).
3. Biologisch. Es kommt auf die Kokultivierung von Aeroben und Anaerobiern in einem geschlossenen System an. Bei dieser Methode der Bakterienkultivierung wird eine Hälfte einer Petrischale mit einigen der aeroben Bakterienarten und die andere Hälfte mit den untersuchten Anaerobiern besät. Seine Entwicklung beginnt in dem Moment, in dem der gesamte Sauerstoff verbraucht ist.

Folgende Aussaatverfahren eignen sich zur Kultivierung anaerober Bakterien:

• in der Oberflächenschicht;
• in der mit sterilem Paraffin gefüllten Oberflächenschicht;
• im Dickicht eines dichten Nährbodens;
• in tiefen Schichten viskoser Medien.

Reinkultur erh alten

Mikrobiologen arbeiten normalerweise mit Proben, die von vielen verschiedenen Arten von Mikroben bewohnt werden. Um jedoch die systematische Position von Mikroorganismen (Familie, Gattung, Art) zu bestimmen und ihre Eigenschaften zu untersuchen, ist es notwendig, sie zu isolieren und eine Reinkultur anzubauen. Sie sind in vielen Lebensmittelindustrien von großer Bedeutung, z. B. Käse, Brot, Kwas, Wein usw. Die Kultivierung von Milchsäurebakterien ermöglicht die Gewinnungein wesentlicher Bestandteil für die Herstellung von fermentierten Milchprodukten, Teig, Kakao, Silage und sogar Kunststoff.

Das Verfahren zur Isolierung einer Reinkultur in dichtem Medium basiert auf der mechanischen Trennung von Mikroorganismenzellen mit anschließender isolierter Kultivierung. Die Probe wird in ein steriles Volumen Wasser oder Kochsalzlösung (Volumen 10–100 ml) überführt und dann zwei Minuten lang geschüttelt. Um Mikroorganismen, die sich in der Dicke des Untersuchungsmaterials (z. B. Wurst oder Käse) befinden, zu extrahieren, werden die Probenstücke zunächst mit sterilen Instrumenten mit Sand abgerieben. Das vorbehandelte Material mit einem Gewicht von 1 g oder einem Volumen von 1 ml wird mit sterilem Wasser 10-, 100-, 1000-mal usw. verdünnt. Der Verdünnungsgrad wird so gewählt, dass sich eine Zellkonzentration ergibt, die den Möglichkeiten der Methode entspricht.

Die anschließende Kultivierung von Mikroorganismen dient der Herstellung eines Nährmediums. Üblicherweise wird ein dichtes Medium (MPA) gewählt. Es wird zunächst geschmolzen und auf 45-50 °C abgekühlt und erst dann in mehrere Petrischalen (drei bis fünf Stück) gegossen, auf deren Boden Tupfer der Testsubstanz unterschiedlicher Konzentrationen platziert werden. Anschließend erfolgt ein Mischen des noch nicht gefrorenen Nährmediums und des darin eingebrachten Materials. So werden Zellen an verschiedenen Stellen im Substratvolumen fixiert.

Als nächstes werden Petrischalen für 2 Tage bei 22 °C in einen Thermostat gestellt. Während dieser Zeit vermehren sich die Zellen so stark, dass die von jeder der Zellen gebildete Kolonie mit bloßem Auge sichtbar wird. Jede von ihnen ist eine Reinkultur der Bakterienart, aus deren Zellen sie stammtRose.

Danach werden aus Petrischalen Mikroorganismen in separaten Reagenzgläsern subkultiviert, die mit einem Nährmedium gefüllt sind. Auf diese Weise werden aus einer Mischprobe Reinkulturen isoliert. Diese Methode trägt den Namen ihres Entwicklers - R. Koch. Es wird auch allgemein als Bechermethode oder erschöpfende Aussaat bezeichnet. Nach Gewinnung von Reinkulturen verschiedener Bakterienarten werden deren Form, Sporen und Familien bestimmt.

Alle Arbeiten müssen nach den Grundsätzen der Asepsis durchgeführt werden. Um eine vorzeitige Entwicklung von Mikroorganismen zu vermeiden, sollte die Untersuchung unmittelbar nach der Probenahme durchgeführt werden. Leitungswasser wird nach dem Ablassen der ersten Portionen analysiert, da es Mikroben enth alten kann, die sich in Rohren und Hähnen angesammelt haben. Die Mikroflora von Obst, Beeren und Gemüse befindet sich hauptsächlich auf der Oberfläche (Schale), daher werden Waschungen von dort durchgeführt. Legen Sie dazu den Fötus in einen sterilen Behälter und füllen Sie ihn mit der erforderlichen Menge Wasser. Dann werden sie ziemlich kräftig geschüttelt und das Wasser wird in einen anderen Behälter gegossen. Ernten aus Stoffprodukten werden auch in Tupfern gewonnen, aber vorher werden Stücke einer bestimmten Größe aus ihnen herausgeschnitten.