Gram-Färbung ist in der Mikrobiologie weit verbreitet, da sie eine der einfachsten Möglichkeiten darstellt, Bakterien anhand der Zusammensetzung ihrer Zellwand zu unterscheiden. Nach Gram lassen sich alle Bakterien in grampositive (Gram (+)) und gramnegative (Gram (-)) einteilen. Die Gram-Färbungsmethode wurde 1884 entwickelt und hat seitdem nicht an Popularität verloren, obwohl sie mehrmals modifiziert wurde.
Struktur der Zellwand
Gram-Färbung zeigt, ob ein Bakterium Gram-positiv oder Gram-negativ ist. Die Einteilung von Bakterien in Gram (+) und Gram (-) erfolgt nach dem Aufbau ihrer Zellwand.
Die Zellwand enthält die größte Menge an Peptidoglykan (Murein) - eine komplexe Substanz, die Peptapeptid und Glykan enthält. Das Glykan besteht aus alternierenden Resten von N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure, die durch β-1 miteinander verbunden sind,4-glykosidische Bindungen. Peptidoglycan sorgt für die Aufrechterh altung der Zellform, osmotischen Schutz und antigene Funktionen.
Hauptunterschiede zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien
Verschiedene Bakterien haben unterschiedliche Peptidoglycan-Schichtdicken. Bei Bakterien, die als grampositiv eingestuft werden, liegt sie zwischen 15 und 80 nm, während sie bei gramnegativen zwischen 2 und 8 nm liegt. Gleichzeitig haben gramnegative Bakterien unter der Peptidoglykanschicht eine spezielle Struktur, die grampositive Bakterien nicht haben - den periplasmatischen Raum. Dieser Raum ist mit hydrolytischen Enzymen gefüllt - β-Lactamase, Ribonuklease 1, Phosphatase. Diese Enzyme sind für die Resistenz gramnegativer Bakterien gegenüber vielen Antibiotika verantwortlich.
Die Gram(-)-Peptidoglykan-Schicht von Bakterien ist an Lipopolysaccharid gebunden, eine antigene Struktur, die Endotoxin enthält. In Gram(+)-Bakterien erfüllen Teichonsäuren ähnliche Funktionen.
Gram-negative Bakterien haben eine zusätzliche Struktur - die äußere Membran.
Die Essenz der Färbemethode
Bevor Sie mit der Färbung beginnen, werden Abstriche der untersuchten Bakterien angefertigt. Dazu wird Wasser auf einen Objektträger getropft und dort eine Kultur von Mikroorganismen mit einer Bakterienschleife hinzugefügt. Dann, nachdem das Wasser vollständig getrocknet ist, wird der Ausstrich fixiert – der Objektträger wird mehrmals über die Brennerflamme geführt. Die Gram-Färbung ist effektiver als die Färbung lebender Bakterien - Farbstoffmoleküle binden besser an tote Zellen.
Das Färben erfolgt in mehreren Schritten:
- Kleine Stücke Filterpapier werden auf einen fixierten Ausstrich gelegt und der Hauptfarbstoff wird gegossen - Enzianviolett oder Methylenblau.
- Nach 3-5 Minuten das farbige Filterpapier entfernen und den Ausstrich für 1 Minute mit Lugolscher Lösung füllen. In diesem Fall verdunkelt sich das Präparat.
- Die Lugol-Lösung wird abgelassen und der Ausstrich mit reinem Ethylalkohol behandelt: einige Tropfen werden auf das Präparat getropft, nach 20 Sekunden abgelassen. Der Vorgang wird 2-3 mal wiederholt.
- Spülen Sie den Objektträger mit destilliertem Wasser.
- Zusätzliche Färbung erzeugen - Präparation mit Fuchsin abschließen. Nach 1-2 Minuten wird der Farbstoff abgewaschen.
- Nachdem das Wasser getrocknet ist, untersuchen Sie den Ausstrich unter einem Mikroskop. Grampositive Bakterien sind blauviolett, gramnegative Bakterien sind rosa oder rot.
Ursachen unterschiedlicher Färbemuster
Wie oben beschrieben, färbt die Gram-Färbung von Bakterien grampositive Bakterien blauviolett, während gramnegative Bakterien rot oder rosa färben. Der Grund für die unterschiedliche Färbung von Bakterien durch dieses Verfahren besteht darin, dass nach dem Eintritt der löslichen Form von Gentianaviolett in die Zelle der Farbstoff in die unlösliche Jodform übergeht. Bei der Behandlung von Bakterien mit Ethylalkohol werden unter Einwirkung dieses unpolaren Lösungsmittels Lipide aus der Membran extrahiert. Die Membran wird dann porös und stellt keine signifikante Barriere mehr für das Auslaugen von Farbstoff dar. JedochPeptidoglycan ist widerstandsfähiger gegenüber unpolaren Lösungsmitteln, einschließlich Alkohol. Er verhindert das Auswaschen des Farbstoffs, so dass Bakterien mit einer dicken Mureinschicht blauviolett (grampositiv) werden und nach der Behandlung mit Alkohol ihre Farbe nicht ändern.
Dünne Mureinschicht aus gramnegativen Bakterien kann die Farbstoffmoleküle nicht in der Zelle h alten, daher werden sie nach Einwirkung von Alkohol farblos - färben gramnegativ.
Nach Einwirkung von Fuchsin auf einen Ausstrich bleiben gramgefärbte Bakterien blauviolett, während gramnegative Bakterien rosarot werden.
Beispiele für Gram(+)- und Gram(-)-Bakterien
Gram-negative Bakterien umfassen Cyanobakterien, Schwefelbakterien, Eisenbakterien, Chlamydien, Rickettsien, Essigsäurebakterien, viele Methylobakterien, Thionbakterien, Arsenitobakterien, Carboxybakterien.
Bifidobakterien, viele Wasserbakterien, Streptokokken und Staphylokokken sind Gram-positiv.
