Absorption und weitere Reemission von Licht durch anorganische und organische Medien ist das Ergebnis von Phosphoreszenz oder Fluoreszenz. Der Unterschied zwischen den Phänomenen ist die Länge des Intervalls zwischen Lichtabsorption und Emission des Strahls. Bei der Fluoreszenz laufen diese Prozesse fast gleichzeitig ab, bei der Phosphoreszenz mit einiger Verzögerung.
Historischer Hintergrund
1852 beschrieb der britische Wissenschaftler Stokes erstmals die Fluoreszenz. Er prägte den neuen Begriff aufgrund seiner Experimente mit Flussspat, der rotes Licht ausstrahlte, wenn er ultraviolettem Licht ausgesetzt wurde. Stokes bemerkte ein interessantes Phänomen. Er fand heraus, dass die Wellenlänge von Fluoreszenzlicht immer länger ist als die des Anregungslichts.
Viele Experimente wurden im 19. Jahrhundert durchgeführt, um die Hypothese zu bestätigen. Sie zeigten, dass eine Vielzahl von Proben fluoreszieren, wenn sie ultraviolettem Licht ausgesetzt werden. Zu den Materialien gehörten unter anderem Kristalle, Harze, Mineralien, Chlorophyll,medizinische Rohstoffe, anorganische Verbindungen, Vitamine, Öle. Die direkte Verwendung von Farbstoffen für biologische Analysen begann erst 1930
Fluoreszenzmikroskopie Beschreibung
Einige der Materialien, die in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts in der Forschung verwendet wurden, waren sehr spezifisch. Dank Indikatoren, die mit Kontrastverfahren nicht erreicht werden konnten, ist die Methode der Fluoreszenzmikroskopie zu einem wichtigen Werkzeug sowohl in der biomedizinischen als auch in der biologischen Forschung geworden. Die erzielten Ergebnisse waren für die Materialwissenschaften von nicht geringer Bedeutung.
Was sind die Vorteile der Fluoreszenzmikroskopie? Mit Hilfe neuer Materialien wurde es möglich, hochspezifische Zellen und submikroskopische Bestandteile zu isolieren. Mit einem Fluoreszenzmikroskop können Sie einzelne Moleküle nachweisen. Eine Vielzahl von Farbstoffen ermöglicht es Ihnen, mehrere Elemente gleichzeitig zu identifizieren. Obwohl die räumliche Auflösung der Geräte durch die Beugungsgrenze begrenzt ist, die wiederum von den spezifischen Eigenschaften der Probe abhängt, ist der Nachweis von Molekülen auch unterhalb dieser Grenze durchaus möglich. Verschiedene Proben zeigen nach Bestrahlung Autofluoreszenz. Dieses Phänomen ist in der Petrologie, Botanik und Halbleiterindustrie weit verbreitet.
Funktionen
Die Untersuchung tierischer Gewebe oder pathogener Mikroorganismen wird oft durch entweder zu schwache oder sehr starke unspezifische Autofluoreszenz erschwert. Allerdings ist der Wert inDie Forschung erwirbt das Einbringen von Komponenten in das Material, die bei einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden und einen Lichtstrom der erforderlichen Intensität emittieren. Fluorochrome wirken als Farbstoffe, die sich selbst an Strukturen (unsichtbar oder sichtbar) anheften können. Gleichzeitig zeichnen sie sich durch eine hohe Selektivität bezüglich Targets und Quantenausbeute aus.
Fluoreszenzmikroskopie ist mit dem Aufkommen natürlicher und synthetischer Farbstoffe weit verbreitet. Sie hatten spezifische Emissions- und Anregungsintensitätsprofile und waren auf spezifische biologische Ziele ausgerichtet.
Identifizierung einzelner Moleküle
Unter idealen Bedingungen können Sie oft das Leuchten eines einzelnen Elements registrieren. Dazu ist unter anderem ein ausreichend geringes Detektorrauschen und optischer Hintergrund erforderlich. Ein Fluorescein-Molekül kann bis zu 300.000 Photonen emittieren, bevor es durch Photobleichung zerstört wird. Mit einer Sammelrate von 20 % und Prozesseffizienz können sie in Höhe von etwa 60.000
registriert werden
Fluoreszenzmikroskopie, basierend auf Avalanche-Fotodioden oder Elektronenvervielfachung, ermöglichte es Forschern, das Verh alten einzelner Moleküle für Sekunden und in manchen Fällen Minuten zu beobachten.
Schwierigkeiten
Das Hauptproblem ist die Rauschunterdrückung durch den optischen Hintergrund. Aufgrund der Tatsache, dass viele der Materialien, die beim Bau von Filtern und Linsen verwendet werden, eine gewisse Autofluoreszenz aufweisen, konzentrierten sich die Bemühungen der Wissenschaftler in den Anfangsstadien auf die AusstellungKomponenten mit geringer Fluoreszenz. Spätere Experimente führten jedoch zu neuen Schlussfolgerungen. Insbesondere die Fluoreszenzmikroskopie auf Basis der Totalreflexion erzielt einen geringen Hintergrund und eine hohe Anregungslichtleistung.
Mechanismus
Die Prinzipien der Fluoreszenzmikroskopie, die auf Totalreflexion basieren, bestehen darin, eine schnell abklingende oder sich nicht ausbreitende Welle zu verwenden. Sie entsteht an der Grenzfläche zwischen Medien mit unterschiedlichen Brechungsindizes. Dabei durchläuft der Lichtstrahl ein Prisma. Es hat einen hohen Brechungsindex.
Das Prisma grenzt an eine wässrige Lösung oder ein Glas mit niedrigen Parametern. Wird der Lichtstrahl in einem größeren als dem kritischen Winkel darauf gerichtet, wird der Strahl an der Grenzfläche vollständig reflektiert. Dieses Phänomen wiederum führt zu einer sich nicht ausbreitenden Welle. Mit anderen Worten, es wird ein elektromagnetisches Feld erzeugt, das ein Medium mit niedrigerem Brechungsindex in einem Abstand von weniger als 200 Nanometern durchdringt.
Bei einer sich nicht ausbreitenden Welle reicht die Lichtintensität völlig aus, um Fluorophore anzuregen. Aufgrund seiner außergewöhnlich geringen Tiefe wird sein Volumen jedoch sehr klein sein. Das Ergebnis ist ein schwacher Hintergrund.
Änderung
Fluoreszenzmikroskopie basierend auf Totalreflexion kann mit Auflichtbeleuchtung realisiert werden. Dies erfordert Linsen mit erhöhter numerischer Apertur (mindestens 1,4, aber es ist wünschenswert, dass sie 1,45-1,6 erreicht) sowie ein teilweise beleuchtetes Feld des Geräts. Letzteres wird mit einem kleinen Fleck erreicht. Für eine größere Gleichmäßigkeit wird ein dünner Ring verwendet, durch den ein Teil des Durchflusses blockiert wird. Um einen kritischen Winkel zu erh alten, ab dem Totalreflexion eintritt, ist eine hohe Brechung des Immersionsmediums in den Objektiven und dem Deckglas des Mikroskops erforderlich.