Bei der Untersuchung von Substanzen in der organischen Chemie werden mehr als ein Dutzend verschiedener qualitativer Reaktionen verwendet, um den Geh alt bestimmter Verbindungen zu bestimmen. Durch eine solche visuelle Analyse können Sie sofort verstehen, ob die erforderlichen Substanzen vorhanden sind, und wenn sie nicht vorhanden sind, können Sie weitere Experimente zu ihrer Identifizierung erheblich reduzieren. Zu diesen Reaktionen gehört Ninhydrin, das bei der visuellen Bestimmung von Aminoverbindungen am wichtigsten ist.
Was ist das?
Ninhydrin ist eine Dicarbonylverbindung, die einen aromatischen Ring mit einem daran gebundenen Heterocyclus enthält, dessen zweites Atom 2 Hydroxylgruppen aufweist (OH-). Diese Substanz wird durch direkte Oxidation von Inandion - 1, 3 gewonnen und hat daher gemäß der internationalen Nomenklatur den folgenden Namen: 2, 2 - Dihydroxyinandion - 1, 3 (Abb. 1).
Reines Ninhydrin ist ein gelber oder weißer KristallFarben, die sich beim Erhitzen gut in Wasser und anderen polaren organischen Lösungsmitteln wie Aceton auflösen. Dies ist eine ziemlich schädliche Substanz, wenn sie in großen Mengen mit der Haut oder den Schleimhäuten in Kontakt kommt, verursacht sie Reizungen, auch beim Einatmen. Arbeiten Sie mit dieser Verbindung vorsichtig und nur mit Handschuhen, da sie bei Hautkontakt mit Hautzellproteinen reagiert und diese violett färbt.
Reaktive Stoffe
Wie oben erwähnt, dient die Ninhydrin-Reaktion hauptsächlich der visuellen Bestimmung des Geh alts an Aminoverbindungen:
- α-Aminosäuren (auch in Proteinen);
- Aminozucker;
- Alkaloide mit –NH2 und -NH-Gruppen;
- verschiedene Amine.
Es sollte beachtet werden, dass sekundäre und tertiäre Amine manchmal sehr schwach reagieren, daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um ihre Anwesenheit zu bestätigen.
Zur quantitativen Bestimmung werden verschiedene Methoden der Chromatographie eingesetzt, zum Beispiel Papierchromatographie (BC), Dünnschichtchromatographie (DC) oder Waschen fester Träger mit einer Lösung von Ninhydrin in verschiedenen Medien.
Diese Reaktion ist nicht spezifisch für Aminoverbindungen, da das Reagenz auf einmal mit allen eintreten kann. Auf Seiten der Reaktionsprodukte weist es jedoch eine Besonderheit in Form der Freisetzung von Kohlendioxidblasen (CO2) auf, die nur bei Wechselwirkung mit α-Amino typisch ist Säuren.
Mechanismusmerkmale
BIn der Literatur gibt es unterschiedliche Interpretationen der Ninhydrin-Reaktionsgleichung. Einige Forscher unterlassen die Bildung von Hydrindanthin aus 2-Aminoinandion, das unter Beteiligung von Ammoniak und Ninhydrin auch einen Farbstoff namens "Rueman's Purple" (oder "Rueman's Blue") bildet, während andere im Gegenteil nur davon ausgehen Teilnahme ohne Anwesenheit von intermediären Aminoprodukten. Es gibt auch einige interessante Punkte in der Aufzeichnung der Reaktion selbst, insbesondere betrifft dies die Methoden zur Bindung des Aminoderivats von Ninhydrin an sein Hauptmolekül, um einen Farbstoff zu bilden. Fraglich bleibt auch die Ortsangabe des „wandelnden Wasserstoffs“, den das intermediäre Amin aus dem wässrigen Medium erhält: er kann entweder in der Ketongruppe oder neben –NH2 stehen.
In Wirklichkeit ist die Nuance mit dem H-Atom unbedeutend, da seine Position in der Verbindung keine besondere Rolle im Verlauf der Reaktion spielt und daher nicht beachtet werden sollte. Was das Weglassen einer der möglichen Stufen betrifft, liegt der Grund hier im theoretischen Aspekt: Da der genaue Mechanismus für die Bildung von Ruemans Purpur bisher nicht genau bestimmt wurde, können ganz unterschiedliche Schemata der Ninhydrin-Reaktion gefunden werden.
Im Folgenden wird ein möglichst vollständiger Interaktionsverlauf des Reagenzes mit Aminoverbindungen vorgeschlagen.
Reaktionsmechanismus
Zunächst interagiert Ninhydrin mit einer α-Aminosäure, bindet sie an die Stelle der Sp altung von Hydroxygruppen und bildet ein Kondensationsprodukt (Abb. 2a). Dann wird letzteres zerstört, wobei das intermediäre Amin, Aldehyd und Kohlendioxid freigesetzt werden (Abb. 2b). Vom Endprodukt beim FügenNinhydrin wird die Rueman-Purpur-Struktur (Diketonhydrindenketohydrinamin, Abb. 2c) synthetisiert. Ebenfalls angedeutet ist die mögliche Bildung von Hydrindanthin (reduziertes Ninhydrin) aus dem intermediären Amin, das sich in Gegenwart von Ammoniak (genauer Ammoniumhydroxid) mit einem Überschuss des Reagenzes selbst ebenfalls in eine färbende Verbindung umwandelt (Abb. 2d).
Die Bildung von Hydrindantin wurde von Rueman selbst nachgewiesen, wenn Schwefelwasserstoff auf das Ninhydrinmolekül einwirkt. Diese Verbindung löst sich in Natriumcarbonat Na2CO3 und färbt die Lösung dunkelrot. Und wenn man verdünnte Salzsäure hinzufügt, fällt Hydrindanthin aus.
Höchstwahrscheinlich befinden sich das intermediäre Amin, Hydridanthin, Ninhydrin und die Struktur des Farbstoffs aufgrund ihrer Instabilität beim Erhitzen in einem gewissen Gleichgewicht, was das Vorhandensein mehrerer zusätzlicher Stufen ermöglicht.
Dieser Mechanismus ist geeignet, die Ninhydrin-Reaktion mit anderen Aminoverbindungen zu erklären, mit Ausnahme von Nebenprodukten, die durch die Absp altung der Reststruktur aus –NH2 entstehen, -NH oder -N.
Biuret-Test und andere Reaktionen auf Proteine
Qualitative Analyse auf Peptidbindungen auch von Nichtproteinstrukturen kann nicht nur unter Beteiligung des oben genannten Reagenzes erfolgen. Bei einer Ninhydrin-Reaktion mit Proteinen findet die Wechselwirkung jedoch nicht entlang von -CO-NH‒-Gruppen statt, sondern entlang von Amingruppen. Es gibt eine sogenannte "Biuret-Reaktion", die durch die Zugabe von Ionen zur Lösung mit Aminoverbindungen gekennzeichnet istzweiwertiges Kupfer aus CuSO4 oder Cu(OH)2 in alkalischem Medium (Abb. 3).
Während der Analyse färbt sich die Lösung in Gegenwart der erforderlichen Strukturen dunkelblau, da Peptidbindungen zu einem Farbkomplex binden, der die einzelnen Reagenzien voneinander unterscheidet. Deshalb sind die Biuret- und Ninhydrin-Reaktionen universell in Bezug auf Protein- und Nicht-Protein-Strukturen mit der –CO-NH‒-Gruppe.
Bei der Bestimmung zyklischer Aminosäuren wird eine Xantoprotein-Reaktion mit einer konzentrierten Lösung von Salpetersäure HNO3 verwendet, die bei Nitrierung eine gelbe Farbe ergibt. Auch ein Reagenztropfen auf der Haut zeigt durch Reaktion mit den Aminosäuren in den Hautzellen eine gelbe Farbe. Salpetersäure kann Verbrennungen verursachen und sollte ebenfalls mit Handschuhen gehandhabt werden.
Beispiele für Wechselwirkungen mit Aminoverbindungen
Die Ninhydrin-Reaktion für α-Aminosäuren ergibt ein gutes visuelles Ergebnis, mit Ausnahme der farbigen Prolin- und Hydroxyprolin-Strukturen, die unter Bildung einer gelben Farbe reagieren. Eine mögliche Erklärung für diesen Effekt wurde in anderen Umweltbedingungen der Wechselwirkung von Ninhydrin mit diesen Strukturen gefunden.
Reaktion mit Aminogruppe
Da der Test nicht spezifisch ist, ist ein visueller Nachweis von Alanin anhand der Ninhydrin-Reaktion im Gemisch nicht möglich. Durch Papierchromatographie kann man jedoch Proben verschiedener α-Aminosäuren auftragen, sie mit einer wässrigen Lösung von Ninhydrin besprühen und in einem speziellen Medium entwickelnBerechnen Sie die quantitative Zusammensetzung nicht nur der beanspruchten Verbindung, sondern auch vieler anderer.
Schematisch folgt die Wechselwirkung von Alanin mit Ninhydrin dem gleichen Prinzip. Es lagert an der Amingruppe an das Reagenz an und wird unter Einwirkung aktiver Hydroniumionen (H3O+) am Kohlenstoff abgesp alten -Stickstoffbindung, die sich in Acetaldehyd (CH3COH) und Kohlendioxid (CO2) zersetzt. Ein weiteres Ninhydrin-Molekül bindet an Stickstoff, verdrängt Wassermoleküle und es entsteht eine farbgebende Struktur (Abb. 4).
Reaktion mit einer heterocyclischen Aminoverbindung
Die Ninhydrin-Reaktion mit Prolin ist spezifisch, besonders bei chromatographischen Analysen, da solche Strukturen in einem sauren Medium zuerst gelb und dann in einem neutralen Medium violett werden. Die Forscher erklären dies durch ein Merkmal der Zyklusumlagerung in der Zwischenverbindung, die genau durch das Vorhandensein einer großen Anzahl von Wasserstoffprotonen beeinflusst wird, die das externe Energieniveau von Stickstoff ergänzen.
Der Heterocyclus wird nicht zerstört, und am 4. Kohlenstoffatom wird ein weiteres Ninhydrinmolekül daran gebunden. Beim weiteren Erhitzen verwandelt sich die resultierende Struktur in einem neutralen Medium in Rueman-Purpur (Abb. 5).
Herstellung des Hauptreagenzes
Ninhydrin-Test wird mit unterschiedlichen Lösungen durchgeführt, je nach Auflösung der Aminostrukturen in bestimmten organischen undanorganische Verbindungen.
Das Hauptreagenz ist die Herstellung einer 0,2%igen Lösung in Wasser. Dies ist eine vielseitige Mischung, da sich die meisten Verbindungen gut in H2O lösen. Um ein frisch hergestelltes Reagenz zu erh alten, wird eine Probe von 0,2 g chemisch reinem Ninhydrin in 100 ml Wasser verdünnt.
Es ist erwähnenswert, dass diese Konzentration für einige analysierte Lösungen nicht ausreicht, sodass 1%ige oder 2%ige Lösungen hergestellt werden können. Dies ist typisch für Extrakte aus medizinischen Rohstoffen, da sie verschiedene Klassen von Aminoverbindungen enth alten.
Bei der Durchführung chromatographischer Studien können Lösungen, beispielsweise beim Waschen einer Mischung auf einem festen Träger durch eine Säule, in Alkohol, Dimethylsulfoxid, Aceton und anderen polaren Lösungsmitteln hergestellt werden - alles hängt vom bestimmten Lösungsmittel ab Aminostrukturen.
Bewerbung
Die Ninhydrin-Reaktion ermöglicht den Nachweis vieler Aminoverbindungen in Lösung, wodurch sie als eine der ersten in der qualitativen Analyse organischer Substanzen eingesetzt wurde. Die visuelle Bestimmung reduziert die Anzahl der Experimente erheblich, insbesondere bei der Analyse von schlecht untersuchten Pflanzen, Arzneimitteln und Darreichungsformen sowie unbekannten Lösungen und Mischungen.
In der Forensik wird diese Methode häufig verwendet, um das Vorhandensein von Schweißspuren auf jeder Oberfläche zu bestimmen.
Auch trotz der Unspezifität der Reaktion ist ein Rückzug der Ninhydrin-Reaktion aus der chemischen Praxis unmöglich, dader Ersatz dieser Substanz durch weniger toxische Analoga (z. B. Oxolin) bewies, dass sie eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Aminogruppen aufweisen und bei photometrischen Analysen keine guten Ergebnisse liefern.
