Molekularbiologische Forschungsmethoden spielen in der modernen Medizin, Forensik und Biologie eine große Rolle. Dank der Fortschritte in der Untersuchung von DNA und RNA ist eine Person in der Lage, das Genom eines Organismus zu untersuchen, den Erreger einer Krankheit zu bestimmen, die gewünschte Nukleinsäure in einem Säuregemisch zu erkennen usw.
Molekularbiologische Forschungsmethoden. Was ist das?
In den 70er und 80er Jahren gelang es Wissenschaftlern erstmals, das menschliche Genom zu entschlüsseln. Dieses Ereignis gab der Entwicklung der Gentechnik und der Molekularbiologie Impulse. Die Untersuchung der Eigenschaften von DNA und RNA hat dazu geführt, dass es nun möglich ist, diese Nukleinsäuren zu verwenden, um eine Krankheit zu diagnostizieren, Gene zu untersuchen.
Gewinnung von DNA und RNA
Molekularbiologische Diagnostikverfahren erfordern das Vorhandensein von Ausgangsmaterial: Häufiger sind es Nukleinsäuren. Es gibt mehrere Möglichkeiten, diese Substanzen aus den Zellen lebender Organismen zu isolieren. Jeder von ihnen hat seine eigenen Vor- und Nachteile, und es ist notwendigbei der Auswahl einer Methode zur Isolierung reiner Nukleinsäuren berücksichtigen.
1. DNA-Gewinnung nach Marmur. Das Verfahren besteht darin, ein Stoffgemisch mit Alkohol zu behandeln, wodurch reine DNA ausfällt. Der Nachteil dieser Methode ist die Verwendung aggressiver Substanzen: Phenol und Chloroform.
2. DNA-Isolierung nach Boom. Als Hauptsubstanz wird hier Guanidinthiocyanat (GuSCN) verwendet. Es trägt zur Ausfällung von Desoxyribonukleinsäure auf speziellen Substraten bei, von denen es anschließend mit einem speziellen Puffer gesammelt werden kann. GuSCN ist jedoch ein Inhibitor von PTC, und selbst ein kleiner Teil davon, der in die präzipitierte DNA gelangt, kann den Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion beeinflussen, die eine wichtige Rolle bei der Arbeit mit Nukleinsäuren spielt.
3. Sedimentation von Verunreinigungen. Das Verfahren unterscheidet sich von den vorherigen dadurch, dass nicht die Moleküle der Desoxyribonukleinsäure ausgefällt werden, sondern Verunreinigungen. Dazu werden Ionenaustauscher verwendet. Der Nachteil ist, dass nicht alle Substanzen ausfallen können.
4. Massenscreening. Diese Methode wird in Fällen verwendet, in denen keine genauen Informationen über die Zusammensetzung des DNA-Moleküls benötigt werden, aber es notwendig ist, einige statistische Daten zu erh alten. Dies erklärt sich dadurch, dass die Struktur der Nukleinsäure bei der Behandlung mit Detergenzien, insbesondere Laugen, geschädigt werden kann.
Klassifikation von Forschungsmethoden
Alle molekularbiologischen Forschungsmethoden werden in drei große Gruppen eingeteilt:
1. Amplifikation (unter Verwendung vieler Enzyme). Hierbezieht sich auf die PCR - Polymerase-Kettenreaktion, die in vielen diagnostischen Verfahren eine große Rolle spielt.
2. Nicht verstärkend. Diese Gruppe von Verfahren steht in direktem Zusammenhang mit dem Betrieb von Mischungen von Nukleinsäuren. Beispiele sind 3 Blots, In-situ-Hybridisierung usw.
3. Verfahren, die auf der Erkennung eines Signals von einem Sondenmolekül beruhen, das an eine spezifische Sonden-DNA oder -RNA bindet. Ein Beispiel ist das Hybride Capture System (hc2).
Enzyme, die in molekularbiologischen Forschungsmethoden verwendet werden können
Viele molekulardiagnostische Methoden beinh alten die Verwendung einer Vielzahl von Enzymen. Unten sind die am häufigsten verwendeten:
1. Restriktionsenzym - „schneidet“das DNA-Molekül in die notwendigen Teile.
2. DNA-Polymerase – synthetisiert ein doppelsträngiges Desoxyribonukleinsäure-Molekül.
3. Reverse Transkriptase (Revertase) – wird verwendet, um DNA auf einer RNA-Matrize zu synthetisieren.
4. DNA-Ligase – verantwortlich für die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleotiden.
5. Exonuklease – entfernt Nukleotide von den Endabschnitten des Desoxyribonukleinsäuremoleküls.
PCR ist die Hauptmethode der DNA-Amplifikation
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird in der modernen Molekularbiologie aktiv eingesetzt. Dies ist eine Methode, bei der eine große Anzahl von Kopien von einem einzelnen DNA-Molekül erh alten werden kann (Moleküle werden amplifiziert).
Hauptfunktionen der PCR:
- DiagnoseKrankheiten;
- Klonierung von DNA-Segmenten, Genen.
Die folgenden Elemente sind erforderlich, um eine Polymerase-Kettenreaktion durchzuführen: das anfängliche DNA-Molekül, eine thermostabile DNA-Polymerase (Taq oder Pfu), Desoxyribonukleotidphosphate (Quellen stickstoffh altiger Basen), Primer (2 Primer pro 1 DNA-Molekül) und das Puffersystem selbst, in dem alle Reaktionen möglich sind.
PCR besteht aus drei Schritten: Denaturierung, Primer-Annealing und Elongation.
1. Denaturierung. Bei einer Temperatur von 94-95 Grad Celsius werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden DNA-Strängen aufgebrochen, und als Ergebnis erh alten wir zwei einzelsträngige Moleküle.
2. Primerglühen. Bei einer Temperatur von 50-60 Grad Celsius werden Primer durch die Art der Komplementarität an die Enden einzelsträngiger Nukleinsäuremoleküle gebunden.
3. Verlängerung. Bei einer Temperatur von 72 Grad erfolgt die Synthese von doppelsträngigen Tochtermolekülen der Desoxyribonukleinsäure.
DNA-Sequenzierung
Molekularbiologische Forschungsmethoden erfordern oft die Kenntnis der Nukleotidsequenz in einem Desoxyribonukleinsäuremolekül. Zur Bestimmung des genetischen Codes wird eine Sequenzierung durchgeführt. Die Molekulardiagnostik der Zukunft basiert auf Erkenntnissen aus der Humansequenzierung.
Folgende Arten der Sequenzierung werden unterschieden:
- Maxam-Gilbert-Sequenzierung;
- Sanger-Sequenzierung;
- pyrosequencing;
- nanoporeSequenzierung.
